基于iTRAQ技术对HBV相关性肝癌血浆差异蛋白的鉴定及功能学研究

【摘要】第一部分基于iTRAQ定量蛋白组学技术对HBV相关性肝癌血浆差异蛋白的鉴定及筛选目的：肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在各种恶性肿瘤中排第六位。在中国HCC高居恶性肿瘤病死率的第二位，慢性乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染是导致HCC最主要的病因之一。目前，乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌（HBV-relatedHCC）的发病机制尚不完全清楚。本研究拟对与HBV相关性肝细胞癌相关的蛋白质进行鉴定及验证。方法：随机选取HBV相关性肝细胞癌、肝硬化（livercirrhosis）、慢性乙型肝炎（chronichepatitisB，CHB）及健康对照人群四组患者的血浆样本，每组15例，分别混合后利用基于iTRAQ联合液相色谱与串联质谱分析的定量蛋白质组学技术，对四组人群血浆蛋白质组进行比较研究，并鉴定出差异表达蛋白质。进一步用实时定量PCR、免疫印迹及免疫组织化学检测等对部分差异蛋白的表达水平加以验证。结果：通过对HBV相关性肝细胞癌与非癌性对照人群混合血浆样品的质谱分析，我们共发现452种非拓余蛋白质，并从中成功鉴定出各队列之间差异表达蛋白21种。这21种差异蛋白涉及到17种蛋白质结构类型、7种分子功能类型，参与人体13种重要的生物学过程。基于文献检索和课题组研究方向，我们从21种差异表达蛋白中选择其中4种，即vWF、SAA、APOE及ALDOB，对随机选取的四组队列患者血浆和癌及癌旁组织样本，分别用免疫印迹、实时定量PCR和免疫组化染色检测对其表达水平进行验证。结果显示4种蛋白表达水平的差异与质谱分析结果一致。进一步研究发现，HBV相关性肝癌患者血浆vWF表达量高于非癌性对照病例；癌组织中vWFmRNA及蛋白表达水平亦明显高于癌旁肝组织。结论：通过iTRAQ定量蛋白质组学技术，我们从HBV相关性肝细胞癌与非癌性对照人群血浆样品中成功鉴定出一批差异表达蛋白，并对其中部分差异蛋白进行了验证。作为质谱分析筛选出来的差异蛋白之一，vWF在肝癌患者血浆及癌组织中的表达水平明显增高，提示vWF可能与HBV相关性肝癌的发病相关。第二部分vWF对肝癌细胞生物学行为和HBV复制的影响及机制研究目的：前一部分研究我们发现，vWF在HBV相关性肝癌患者血浆及癌组织中的表达水平明显增高，提示vWF可能与肝癌的发生、发展相关。在本部分研究中，我们主要探究vWF对肝癌细胞株生物学行为以及HBV复制的影响及其作用机制。方法：我们采用siRNA转染技术下调HCC细胞株vWF的表达水平。转染48小时后用免疫印迹法验证敲出效果。转染成功后，采用划痕实验、Matrigel侵袭实验评估下调vWF表达后肝癌细胞株体外迁移与侵袭能力。流式细胞学检测细胞周期与细胞凋亡的变化。MTS法检测细胞增殖能力。采用免疫印迹法检测肝癌细胞株STAT3,pSTAT3,MMP2,MMP9,integrinαvβ3andGal-1的表达水平。ELISA和实时定量PCR法定量检测转染vWF-siRNA的HepG2.2.15细胞培养基上清中HBsAg、HBeAg和HBVDNA浓度，以及细胞内I型干扰素及其下游干扰素激活基因的mRNA转录水平。结果：成功转染vWFsiRNA后，伴随vWF表达减少，肝癌细胞株的体外迁移与侵袭能力明显受损；细胞发生G2/M期阻滞，凋亡比例增加，增殖能力降低。同时，细胞STAT3、pSTAT3、MMP2、MMP9表达水平有不同程度的降低；细胞表面整合素αvβ3表达与功能异常；细胞表达Gal-1亦明显下降。此外，转染vWFsiRNA后，HepG2.2.15细胞分泌HBVDNA、HBsAg及HBeAg的滴度降低，并伴随有I型IFN及部分下游干扰素诱导基因（ISG15，OAS1，OAS2，RNaseL和EIF-2α）mRNA表达水平增高。结论：vWF可能是HBV感染及其相关性肝癌发病机制中的关键分子之一，通过影响STAT3通路活化及其下游MMP2、MMP9表达，引起肝癌细胞整合素αvβ3、Gal-1等生物活性分子的表达和/或功能异常，干扰I型IFN抗病毒信号通路转导等，多种途径影响肝癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭，以及HBV复制。第三部分vWF与HBV相关性肝癌诊断及临床病理分期的相关性研究目的：我们先前的研究表明vWF在HBV相关性肝癌患者血浆及癌组织中的表达量明显增高。本部分研究旨在评估vWF表达水平与HBV相关性肝癌诊断及临床病理分期的相关性。方法：采用ELISA试剂盒定量检测HBV相关性肝癌、肝硬化、慢性乙型肝炎和健康对照四组患者血浆vWF浓度。用免疫组织化学法检测vWF在肝癌组织中的表达水平，并用一半定量评分系统进行量化评分。用受试者工作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC）分析评价vWF对肝癌的预测能力。Spearman秩相关分析检验vWF表达水平与肝癌临床病理分期之间的相关性。结果：HBV相关性肝癌、肝硬化、慢性乙型肝炎和健康对照组患者平均血浆vWF浓度分别为2322±1089mU/mL、1760±1217mU/mL、866±417mU/mL和317±66mU/mL；各组间两两比较具有统计学差异。ROC分析表明血浆vWF对HCC的预测效能要高于AFP，其曲线下面积（areaundertheROCcurve，AUC）为0.830，以1100mU/mL为临界值，灵敏度为91.8%，特异性为71.0%，较之AFP的0.719，70.2%，62.5%有明显提高。此外，vWF在血浆及肝癌组织中的表达水平与肝癌患者TNM分期之间存在一定相关性，其相关系数分别达到0.821（P<0.05）和0.691（P<0.05）。结论：初步研究表明，vWF可能是一个非常有潜力的HBV相关性肝细胞癌诊断与病情监测的血浆标记物。其临床应用价值，还有待我们进一步扩大病例规模，通过多中心前瞻性随机对照试验加以验证。
【作者】刘毅；
【导师】任红；
【作者基本信息】重庆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】肝细胞癌；乙型肝炎病毒；vWF；iTRAQ；

【参考文献】
[1]胡文婷.磺基苯甲酸钌配合物的合成、结构和催化性质研究[D].浙江大学,化学,2013,硕士.
[2]宫廷秀.某舰结合中修进行现代化改装设计与建造[D].大连理工大学,动力工程,2002,硕士.
[3]林铁源.DLC薄膜力学响应的有限元分析[D].东北大学,流体机械及工程,2009,硕士.
[4]申建国.我国自主品牌乘用车营销策略分析[D].吉林大学,工商管理,2012,硕士.
[5]胡玉玲,王飞跃,刘希未.基于ACP方法的高层建筑火灾中人员疏散策略研究[J].自动化学报,2014,02:185-196.
[6]刘亮.改善微波功率SiGe HBTs线性度的仿真研究[D].北京工业大学,微电子学与固体电子学,2004,硕士.
[7]袁峻萍.基于ADAMS和双响应面法的车辆悬架系统稳健设计[D].华东交通大学,车辆工程,2013,硕士.
[8]田少华.FF公司营销系统人力资源管理研究[D].河北大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[9]黄翠.两类双参数半群与n阶抽象Cauchy问题[D].中国矿业大学,运筹学与控制论,2014,硕士.
[10]江夏.水处理沉淀工艺强化及水量变化适应性研究[D].哈尔滨工业大学,市政工程,2013,硕士.
[11]姚荣洁.中国“高学历失业”问题研究[D].吉林财经大学,政治经济学,2014,硕士.
[12]常晓青.浙江省企业自主创新风险问题研究[D].浙江工业大学,2006.
[13]黄鹤,韩笑冬,谢德晓,王执铨.具有数据包丢失的网络控制系统主动容错控制[J].控制与决策,2009,08:1126-1131.
[14]胡曲应.我国会计师事务所引入客户关系管理理念的研究[D].武汉大学,2004.
[15]韩光.曲轴镦锻成形胀模力影响因素及锁紧方案研究[D].燕山大学,机械工程,2014,硕士.
[16]鲁娜.股票市场定价制度变迁对首次公开发行股票抑价的影响研究[D].河北经贸大学,会计学,2013,硕士.
[17]严洁.两层间的退让接触平面问题[D].宁夏大学,应用数学,2014,硕士.
[18]王汉江.BSD包过滤器（BPF）的研究与改进[D].浙江大学,计算机应用,2004,硕士.
[19]佟光霁,王海赛.哈尔滨市经济增长与环境污染的关系研究[J].经济师,2014,11:151-153+157.
[20]王维.以“六安瓜片”为例探究皖西绿茶产业特性及发展对策[D].首都经济贸易大学,产业经济学,2014,硕士.
[21]王新峰.机电系统BIT特征层降虚警技术研究[D].国防科学技术大学,2005.
[22]陈雨彤.民办院校人力资源管理问题研究[D].华中师范大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[23]管玉龙.Ka波段谐波混频器设计与仿真[D].电子科技大学,2013.
[24]宫英芳.居住区老年公共服务设施设计方法研究[D].长安大学,城市规划与设计,2014,硕士.
[25]肖芳.低温型木霉菌的分类鉴定及其对辣椒疫霉抑制作用的研究[D].浙江大学,植物病理学,2012,硕士.
[26]俞雪婷.救援便携定位系统的设计与实现[D].东北大学,模式识别与智能系统,2010,硕士.
[27]王战.中国石油电子商务模式研究[D].大连理工大学,工商管理,2003,硕士.
[28]王琦.试论大学自治的限度[D].山东大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[29]刘欢.串联补偿装置中脉冲变压器的研究[D].北京交通大学,2014.
[30]黄斯茜.智能视频分析算法在变电所中的研究与应用[D].西南交通大学,电力系统及其自动化,2012,硕士.
[31]黄如君.基于XBRL财务报告的行业景气分析[D].山东财经大学,会计学,2013,硕士.
[32]罗思宜.奔驰品牌汽车经销商岗位胜任力模型研究[D].厦门大学,工商管理,2014,硕士.
[33]王蕾.基于共轭聚双吡啶盐的肝素荧光传感器[D].天津理工大学,2014.
[34]杨靓.幼儿社交退缩行为游戏干预的个案研究[D].山东师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[35]刘莉莉.企业文化视野下的员工培训比较研究[D].华东师范大学,比较教育学,2002,硕士.
[36]邹夏清.中国电影的国际化路径研究[D].重庆工商大学,传播学,2014,硕士.
[37]王艳霞.晶粒大小对AZ31镁合金板材弯曲中性层的偏移和回弹的影响[D].重庆大学,材料科学与工程,2014,硕士.
[38]严大香.电子资源利用跟踪分析[J].图书馆建设,2005,06:63-65.
[39]卢樟锋,杜胜吉,方家宏,潘志超,江涛,唐绍春.建筑淤土免烧陶粒的绿色度评价[J].山西建筑,2015,01:113-114.
[40]周庚如.高温超导微波器件在电子战中的应用[J].宇航计测技术.1993(01)
[41]李云辉.稀土—铝双金属体系催化分子间氢烷氧化反应和胍化反应的研究[D].苏州大学,有机化学,2013,硕士.
[42]戴小平.无烟煤自然发火的实验研究及机理的探讨[D].重庆大学,采矿工程,2003,硕士.
[43]赵静.基于专利文本分析的天士力中药类发明专利战略的研究[D].北京中医药大学,社会医学与卫生事业管理,2013,硕士.
[44]王西文.把握行业发展动向,促进地球物理勘探技术进步——对2001年《石油地球物理勘探》的评述[J].石油地球物理勘探,2002,03:300-306.
[45]杨涛,李朝阳,张际宁.南京市道路与交通流现状、问题及对策[J].城市研究.1999(02)
[46]孙智勇.论柏辽兹《幻想交响曲》的结构特征[D].吉林大学,音乐学,2013,硕士.
[47]李佩娟,徐晓苏,张小飞,蔡玮.基于极大后验估计和模糊控制的水下无源定位技术[J].控制与决策,2014,02:363-367.
[48]宋明秀.山东省环境规制对FDI区位分布的影响[D].山东财经大学,国际贸易学,2013,硕士.
[49]曾伟军,李健.互联网文献检索与挖掘[J].现代计算机(专业版),2002,04:98-100.
[50]陈燕.丹瓜方对转基因ApoE-/-糖尿病小鼠氧化应激的干预研究[D].福建中医药大学,中西医结合临床,2014,硕士.